Als Mario auf Peachs Einladung hin auf ihrem Schloss eintrifft, muss er feststellen, dass die Prinzessin wieder einmal von Bowser und seinen Spießgesellen entführt wurde. Doch diesmal ist alles anders: Mario macht den Sprung in die dritte Dimension!
Auf der Suche nach 120 Powersterne springt er durch die Gemälde an der Wand und entdeckt in riesigen, magischen Welten jede Menge anspruchsvolle Hinderniskurse, verborgene Gegenstände und Rätsel sowie ein wahres Heer an Gegnern! Mario stehen zahlreiche Bewegungsarten zur Verfügung – er kann laufen, springen, schwimmen, stampfen, schlagen und einen Salto rückwärts machen, mit dem er selbst auf die höchsten Plattformen gelangen kann. Besondere Mützen verleihen ihm für kurze Zeit besondere Kräfte, etwa die Fähigkeit zu fliegen – und wenn sich Unruhestifter Marios Mütze schnappen, muss er sie sich zurückholen!
Mario läuft völlig frei über eine Wiese, geht auf Zehenspitzen durch ein düsteres Verlies, klettert auf einen schneebedeckten Berg, zischt über Lavaseen und schwimmt durch den Wassergraben des Schlosses. Er kann eine alte Pyramide erforschen und sogar ein Wettrennen gegen Koopas veranstalten, um tolle Preise zu gewinnen. Und natürlich muss er auch gegen seinen Erzfeind Bowser kämpfen, den König der Koopas – und das nicht nur einmal, sondern gleich dreimal!